項英在中央蘇區和毛澤東就不對付，他雖然不算“28個半”但對毛素來輕視。項英資格老正宗工人運動出身，當年毛在紅軍內部大搞AB團濫殺無辜，紅軍大將士被殺時都搞不清楚，原來AB團是Anti-Bolshevik的簡稱。項英本來想極力制止，卻被毛誣陷是AB團的總後台。被撤銷蘇區中央局代理書記，改任軍委副主席。
抗戰開始後項英擔任新四軍副軍長，中共中央東南局分局（後東南局）書記、中共中央軍委新四軍分會書記，率總部千餘工作人員，還有8千部隊駐紮在雲嶺。1940年12月項英總部的部隊，稱為新四軍長江以南唯一部隊，毛把超過9成的新四軍調到江北，由他的親信劉少奇掌管，並成立了“江北指揮部”，項英江南部隊數量不多。
1940年7月蔣介石命令新四軍北上華北，長江流域由國民黨統一掌控，過江總共有兩條路可以選擇。一條直接北上皖東的繁昌和銅陵渡口，另一條朝東南方向走長江下游江蘇南部鎮江渡江。12月10日，蔣介石命令項英走“皖東路”，蔣介石給顧祝同發電：“查蘇北匪偽不斷進攻韓部，為使該軍江南部隊，不致直接參加對韓部之攻擊，應不準其由鎮江北渡，只准其由江南原地北渡”。
毛澤東在7月收到蔣介石命令，當時並未予以理會。遲到12月29日毛批准項英，按蔣指定路線過北，他對項英說，“同意直接移皖東分批渡江”。但剛過1天毛突然打電報，要項英改道“走蘇南為好。”對於這次路線改動毛沒有通知蔣介石，蔣介石完全以為是事前安排的“皖東路段”。19411年1月3日，發特意發電新四軍軍長葉挺，再次重申必須走皖東線，並稱“沿途已令各軍掩護。”
項英此時發現蔣介石對改路線不知情，趕緊在4日發電給蔣再次通知。問題是毛澤東早就禁止，所有將領直接與蔣介石聯繫，全部聯絡需要先經他本人，然後再由周恩來轉交。當時項英發完電報也不放心，再度拖延到晚上才出發。他認為蔣介石應該收到電報。等一段時間則沿途駐紮國軍，估計也得到了蔣讓路命令。毛澤東壓下項英1月4日電報，在他在1月13日給重慶周恩來電報中可見端倪。“軍機前轉上葉項支（四）日致蔣電，措詞不當如未交請勿交。”
江南新四軍1月4日風雨交加夜，領進入國民黨十幾萬大軍駐紮區。國民黨軍隊沒有接到轉移路線命令，以為是新四軍進攻自然開火。之前“黃橋之戰”吃了虧的顧祝同，為此6日下令“徹底加以肅清”，最後導致“皖南事變”爆發。此時項英情急之下還是不斷發報延安，仍希望毛澤東向國民黨解釋，儘快讓周恩來交涉停火，但毛自然是音訊全無。拖到9日新四軍江北指揮部，劉少奇都發現情況不對，去電毛才回復不知情。他5日後沒得到項英電報，僅知道葉項4日夜出發，5日晨到太平涇縣間，此後即不明了。國民黨軍隊在1月6-9日，圍殲項英部發生激烈戰鬥，項英向延安求救電報不斷，劉少奇都收毛沒收到。
毛的電台正常與否歷來看他心情，西安事變莫斯科要他釋放蔣介石，當時他也稱電報沒有收到。紅四方面軍進入西部被包圍，要求突圍時他電報也沒收到。總算收到劉少奇1月9日電報後，毛電台工作恢復正常了。10日，新四軍總部報告毛：“支持四日夜之自衛戰鬥今已瀕絕境，幹部全部均已準備犧牲。”“請以黨中央及恩來名義速向蔣顧交涉，以不惜全面破裂威脅，要顧撤圍或可挽救。”毛自然還是不為所動。
到了10日當天項英已經比較清醒，直接給蔣介石發了求救電報。電報還是發到毛手裡，毛再次把電報壓了下來。毛對周恩來說項英此封電報，“比前一封立場更壞”，“此電決不能交故未轉你處。”周恩來11夜在重慶開酒會，慶祝《新華日報》3周年，毛關於新四軍總部被圍電報才到，但不是命令周與國民黨交涉停火，而只是讓他將情況通報一下。
直到12日項英部隊快被消滅了，毛才讓周“向國民黨提出嚴重交涉即日撤圍”。但毛降低事件的緊急性，以“據雲尚可固守七天”。周恩來遲在13日才向國民黨抗議，蔣介石已在前一天，主動下令停止攻擊了。新四軍總部被消滅了毛興奮起來，讓周恩來“向全國呼籲求援”，命令“軍事上立即準備大舉反攻”。“已不是增兵威脅問題，而是如何推翻蔣介石統治問題。”“一下決心就要打到四川去，打到底。”
為此周恩來1月15日，去見蘇聯大使潘友新，說中共急需蘇聯的救助。潘當時就懷疑“皖南事變”，就是毛澤東有意讓項英去送死，而周恩來向他撒謊。周謊稱新四軍總部和延安電訊聯繫，時間是13日下午才中斷的，結果蘇方對此不為所動。毛只得繞過潘友新，直接向莫斯科懇請，發了蘇聯人後來稱為“一封又一封歇斯底里的電報”。毛稱蔣介石計劃先後剿滅新四軍和八路軍，然後“摧毀中國共產黨”，“我們有被斬盡殺絕的危險”。
莫斯科根本不相信毛的危言聳聽，並把意思轉給了中共。毛不死心再發電報要求“呈交史達林同志，使他能夠估量中國形勢，考慮能否給我們具體的軍事援助。”如此把史達林惹火了，1月21日在列寧紀念儀式上，史達林以譴責新四軍軍長葉挺名義，指桑駡槐道“一個不守紀律打遊擊的”，“查查看事變是不是他挑起的。我們也有些打遊擊的，人是好人但我們不得不把他們槍斃掉，就是因為他們不守紀律。”季米特洛夫為此再次嚴重警告毛，“不要挑起破裂。”
季米特洛夫明白史達林的意思，“中國同志在不顧後果地追求破裂。我們決定向毛澤東同志點明他的不正確的立場。”2月13日史達林批准了季米特洛，夫寫給毛本人的命令。“我們認為破裂不是不可避免的，你不應該竭力製造破裂。相反地你應該盡一切努力防止內戰發生。請重新考慮你在這個問題上的立場。”毛看後只好表態“服從您的指令”。
莫斯科的態度雖然令毛沮喪，但畢竟項英除掉了。新四軍英勇激戰7晝夜，除2千餘人分散突圍外，少數被俘大部犧牲，軍長葉挺被扣。副軍長項英和副參謀長周子昆，突圍後在涇縣蜜蜂洞躲藏。3月14日深夜項英在山洞裏睡覺時，被副官劉厚總打死。項英好在“及時犧牲”，當他拼死沖出國民黨包圍圈時，毛澤東已經以中央名義發決議，把“皖南事變”新四軍被殲的罪名，都給他已經定好了。項英“一貫機會主義領導的結果”。甚至指項英是內奸“此次失敗是否有內奸陰謀存在尚待考查，但其中許多情節是令人懷疑的。”
蔣介石為此備受“挑起內戰”壓力，蘇聯要求他允許新四軍留在長江流域發展。潘友新大使注意到蔣怒不可遏，“非常神經質地接受了我的聲明。”美國羅斯福總統也跟史達林一樣，想要中國牽制日本不能內戰。警告蔣要援助就不要打內戰，不管是誰發動的都不行。“皖南事變”時美國媒體稱，華盛頓打算把準備給中國的五千萬美金貸款壓下來，等中國不打內戰了再說。
英國大使科爾(ClarkKerr)立場相同，打起內戰來英國不會支持蔣，無論是誰挑起的。皖南事變時他的彙報也偏向中共，如此蔣介石“挑起內戰”，發動“皖南事變”的說法“做實了”。莫斯科同時在西方組織，聲勢浩大反蔣宣傳，稱蔣介石屠殺1萬新四軍。實際數字是死亡2千餘人，3千新四軍成功逃脫。他們沖出包圍圈後，按照蔣介石事前指定的皖東路，很順利地安全渡過長江。
蔣怕打內戰的消息影響國內士氣和國際援助，因此“皖南事變”後他選擇沉默，沒有進行任何辯解。甚至直到現在很多人，仍然認為國民黨發動“皖南事變“，蔣介石要消滅共產黨軍隊。迫於國際壓力蔣在1月29日，讓國民政府駐蘇聯大使，請克裡姆林宮調停。蘇聯人要蔣介石讓新四軍留在長江流域，中共奪取的別的地盤也都照舊，蔣介石無奈之下只得答應。
毛澤東事後得意地對中共將領說，“蔣介石無論他怎樣造反，但鬧來鬧去只會把他自己鬧垮臺的。”王明1941年1月在延安寫了一首紀念項英的七律詩，《工人柱石——悼皖南事變犧牲的項英同志》。毛家詭計蔣家兵，主要目標殺項英。舉國勞工哭柱石，全民抗戰損干城。回思上海同風雨，直覺胸中盡刺針。黨事如今多邪道，無邊憂慮望前程。
